提高色譜柱柱效的方法！你了解了嗎？

色譜柱的柱效能是評價(jià)色譜性能的一項重要指標，混合物能否在色譜柱中得到分離，除取決于選擇合適的固定相外，還與色譜操作條件及色譜柱的裝填狀況等因素有關(guān)。在一定的色譜操作條件下，色譜柱的柱效可用理論塔板數或理論塔板高度來(lái)衡量。一般說(shuō)來(lái)塔板數愈多，或塔板高度愈小，色譜柱的分離效能愈好。

    如何對柱效進(jìn)行評價(jià)    

實(shí)驗儀器與試劑

儀器：液相色譜儀（帶自動(dòng)進(jìn)樣器，或配置微量進(jìn)樣器）、分析天平。

試劑：苯、萘、聯(lián)苯（均為分析純）、甲醇（色譜純）、純凈水。

實(shí)驗步驟

色譜條件：色譜柱：C18，4.6×150mm，5μm；流動(dòng)相：甲醇-水（80：20，v/v）；

檢測波長(cháng)：254nm；流速：1mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

操作步驟：

分別精密配制含苯、萘、聯(lián)苯濃度均為約1mg·mL-1的3份對照品溶液各10mL。

分別精密吸取上述對照品溶液各2mL置于10mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋?zhuān)⒍ㄈ葜量潭?，搖勻，得到含苯、萘、聯(lián)苯的混合對照品溶液。

按照上述色譜條件操作，進(jìn)樣，記錄色譜圖。

計算各色譜峰的理論塔板數及各峰間分離度。

實(shí)驗數據處理

    如何提高HPLC柱效    

要提高液相色譜的效率可從以下幾方面入手。 以下介紹了幾種上流行的測量和計算柱效值的方法。

提高液相色譜柱柱效的方法

 （1）降低移動(dòng)相的流速,但會(huì )使分析時(shí)間延長(cháng)。

（2）減少固定相的量,但色譜柱中樣品的負載量也隨之減小。

（3）減小固定相的顆粒度,但不能過(guò)分,過(guò)分后色譜柱的滲透率也會(huì )減小。

（4）選用低粘度的移動(dòng)相,以利于快速傳質(zhì),但卻不利于多組份分析。

（5）適當提高柱溫,可降低移動(dòng)相的粘度,但柱效和分離度也隨之降低。

（6）盡量減小停滯移動(dòng)相的體積,但卻加快了移動(dòng)相的流速。

從以上介紹可看出,在色譜分析過(guò)程中,各種因素是互相聯(lián)系和制約的。只有通過(guò)對柱效值的跟蹤測算,對自己分析方法不斷的研究和實(shí)踐,才能找到更好的工作條件。

對柱效值進(jìn)行跟蹤測算應注意的問(wèn)題

我們也應記住柱效值并不足以預測在所有條件下的柱性能，對大多數色譜工作者來(lái)說(shuō),柱性能指的是色譜柱用于特定分離的能力,而僅僅有高柱效并不能保證這種分離能力。

不管用什么特定的測試方法,都會(huì )有幾個(gè)參數影響柱效的測定。這些參數包括:洗脫液的成分和粘度及其線(xiàn)流速,測定塔板數所用的溶質(zhì),溫度,柱長(cháng),填料裝填方式,顆粒度,還有所選用的測量和計算方法。而測量和計算方法對柱效值的確定起著(zhù)極大的作用。

幾種測量和計算柱效值的方法

因為色譜峰是假定樣品濃度在移動(dòng)相和固定相中呈正態(tài)分布而得到的樣品譜帶分布,故常常把色譜峰型看作正態(tài)曲線(xiàn)來(lái)計算理論塔板數。因此計算柱效（以理論塔板數n為單位）的公式習慣上定義為：

式中tR為色譜峰的保留時(shí)間;σ2是以時(shí)間為單位測量色譜峰的偏差;a是和峰高（從測峰寬的基線(xiàn)量起）有關(guān)的常數,ωb是峰寬,表示由色譜峰頂點(diǎn)與色譜峰兩側拐點(diǎn)處做切線(xiàn)與峰底基線(xiàn)相交兩點(diǎn)間的距離。

結論

假如一個(gè)色譜峰真是正態(tài)峰型,那么每種計算方法都會(huì )得到同樣的結果。然而即使一些比較理想的儀器和傾向于得到對稱(chēng)峰型的溶質(zhì),由于柱內的槽或空隙,也會(huì )出現非正態(tài)峰型。所以不同的計算方法將會(huì )得到相差較大的n值。通常偏離正態(tài)模型的峰型表示為“前延”或“拖尾”。對于這些峰型,越在峰的高處測量,計算的理論塔板數值就越大（準確性越低）。在許多情況下,色譜工作者需要能反映整個(gè)峰型（包括拖尾）的柱效值,同時(shí)為了保證定量的重復性,也需要色譜峰很好的對稱(chēng)性。這時(shí)對色譜峰非對稱(chēng)性敏感的計算方法適合。如果目的僅僅是要監測色譜柱從次使用到使用壽命結束這一過(guò)程中的柱效,那么以上任何一種方法都可以,應選擇簡(jiǎn)便的方法。

    如何提高氣相色譜柱柱效    

在實(shí)際工作中，我們通過(guò)對載氣流速、進(jìn)樣技術(shù)、氣化室溫度、色譜柱、柱溫、檢測器溫度這六個(gè)方面的選擇，有效地提高了柱效率，使分析出的色譜峰峰形正常，無(wú)峰形擴張、拖尾、峰漏檢等不良現象出現，分離度高，從而提高了分析結果的準確性。

所為柱效就是在較短的時(shí)間內，用較短的柱子達到滿(mǎn)意的分析結果。為了提高色譜柱的柱效率，減少色譜峰擴張、拖尾及峰漏檢等現象，在實(shí)際工作中，我們從以下六個(gè)方面入手，對柱操作條件的選擇進(jìn)行了探討。

載氣流速的選擇

氣相色譜常用的載氣是：氫氣、氮氣、氬氣、氦氣。

由速率理論可知，載氣流速慢有利于傳質(zhì)，有利于組分的分離，但分析時(shí)間會(huì )加長(cháng)；如果載氣流速快有利于加快分析速度，減少分了擴散，但分離度降低。有時(shí)為了縮短分析時(shí)間，加大流量，但此時(shí)分離效果并不好?？梢?jiàn)載氣流速的快慢都會(huì )降低柱效。經(jīng)過(guò)長(cháng)時(shí)間的實(shí)驗，發(fā)現對于一般色譜儀而言，載氣流量為20-100ml/min。目前我們分析液化氣用的是熱導檢測器，載氣用的是氫氣，其流量控制是30 ml/min。分析戊烷發(fā)泡劑用的是氫火焰離子化檢測器，載氣用的是氮氣、燃燒氣氫氣和氧氣，這三種氣體的體積比是氮氣：氫氣：氧氣為1：1：10，分析效果都是較好的。

進(jìn)樣技術(shù)的選擇

在氣相色譜分析中，一般采用注射器或六通閥門(mén)進(jìn)樣。在考慮進(jìn)樣技術(shù)的時(shí)候，以注射器進(jìn)樣為主來(lái)研究。

進(jìn)樣量：如果在進(jìn)樣過(guò)程中進(jìn)樣量大會(huì )導致：分離度??；保留值變化難于定性；峰高和峰面積與進(jìn)樣量不成線(xiàn)性關(guān)系，不能定量。進(jìn)樣量與氣化溫度、柱容量和儀器的線(xiàn)性響應范圍等因素有關(guān)。進(jìn)樣量應控制在瞬間氣化，達到規定分離要求和線(xiàn)性響應的允許范圍內。填充柱沖洗法的瞬間進(jìn)樣量:液體樣品或固體樣品溶液一般為0.01～10μl,氣體樣品一般為0.11～10ml,在定量分析中,應注意進(jìn)樣量讀數準確。

注射器里空氣的排除：用微量注射器抽取液體樣品,只要重復地把液體抽入注射器又迅速把其排回樣品瓶,就可以將空氣排除。還有一種更好的方法,那就是用計劃注射量的約2倍的樣品置換注射器3～5次,每次取到樣品后,垂直拿起注射器,針尖朝上，留在注射器里的空氣都應當跑到針管頂部，推進(jìn)注射器塞子,空氣就會(huì )全部被排掉。

保證進(jìn)樣量的準確：用經(jīng)置換過(guò)的注射器取約計劃進(jìn)樣量2倍左右的樣品,垂直拿起注射器,針尖朝上,讓針穿過(guò)一層紗布,這樣可用紗布吸收從針尖排出的液體。推進(jìn)注射器塞子,直到讀出所需要的數值。用紗布擦干針尖。至此準確的液體體積已經(jīng)測得,需要再抽若于空氣到注射器里。如果不慎推動(dòng)柱塞,空氣可以保護液體使之不被排走。

進(jìn)樣手法：雙手拿注射器。用一只手(通常是左手)扶針插入墊片,注射大體積樣品(即氣體樣品)或柱前壓力*時(shí),要防止從氣相色譜儀注樣器來(lái)的壓力把注射器活塞彈出(即用右手的大拇指按壓住活塞頂部)。讓針尖穿過(guò)墊片盡可能深的進(jìn)入進(jìn)樣口,壓下注射器活塞停留1秒鐘,然后盡可能快而穩地抽出針尖（抽出的同時(shí)繼續壓住注射器活塞)。

進(jìn)樣時(shí)間：進(jìn)樣時(shí)間長(cháng)短對柱效率影響很大。若進(jìn)樣時(shí)間過(guò)長(cháng),遇使色譜區域加寬而降低柱效率。因此,對于沖洗法色譜而言,進(jìn)樣時(shí)間越短越好,一般必須小于1秒鐘。

氣化室溫度的選擇

氣化室溫度取決于樣品的化學(xué)和熱穩定性、沸程范圍、進(jìn)樣口類(lèi)型等。合適的氣化室溫度即能保持樣品瞬間*氣化，又不引起樣品分解。溫度過(guò)低，氣化速度比較慢，使峰形不規則，出現平頭峰或伸舌峰；溫度過(guò)高使出峰數目變化，產(chǎn)生前延峰，甚至樣品分解。為選擇合適的氣化室溫度，在多次的進(jìn)樣中我們發(fā)現，氣化室溫度比柱溫高50-100℃或比樣品組分中高沸點(diǎn)高50-70℃較為合適。溫度過(guò)高過(guò)低都會(huì )影響柱效。

    網(wǎng)友支招    

一般柱效不好，先排除其他問(wèn)題，都沒(méi)有問(wèn)題的話(huà)就是柱子不行了。

如果柱子比較老，可以反過(guò)來(lái)小流速沖洗一下，我做過(guò)效果很好?。▋H適用舊柱子啊，有點(diǎn)風(fēng)險）。

把柱頭變色的填料挖掉，用同類(lèi)新的填料填充好，效果很好。

正向沖洗色譜柱、反向沖洗色譜柱、超聲清洗色譜柱篩板、如果是柱內死體積增加則需更換新柱。

色譜柱是消耗品，理論來(lái)說(shuō)，柱效很低的色譜柱是沒(méi)得救的，但是有一招，也就是當你發(fā)現色譜柱沒(méi)得救的時(shí)候可以用一下，就是反沖色譜柱，但是你要注意的是，流速不要設置太大，這樣的話(huà)還能再堅持一會(huì )。如果這樣也沒(méi)用的話(huà)，你就重新買(mǎi)吧。

如果柱子真的很老舊了，就反相沖洗試試，可能還能用一段時(shí)間，但不會(huì )太久。在然后就只能換填料了，或換新的柱子。

我們前段時(shí)間也是柱效不好，其他都比較正常。后來(lái)把柱子重新活化了一下，柱效由原來(lái)的兩千升到四千多了。不過(guò)維持了一個(gè)月又不行了。

    總結    

柱子溫度能調高，第二可選柱子內徑小。第三柱外體積小更妙，第四使用超純的硅膠。第五氘燈要選能量高，第六采用中空透光燈。第七改變有機相比率，第八流動(dòng)相pH可鼓搗。第九可把鍵合相選挑，第十改變有機添加劑。十一改變流動(dòng)相配比，十二縮短檢測響應時(shí)間。