LC-MS靈敏度：提升信號和降低噪音的實(shí)用策略

       液相色譜 - 質(zhì)譜（LC-MS）已成為許多具有挑戰性的分析的首xuan分析技術(shù)，基于其選擇性，靈敏度和對不同極性化合物的廣泛適用性。盡管該技術(shù)具有優(yōu)勢，但LC-MS系統的復雜性常常使分析人員難以滿(mǎn)足方法檢測限制。在“Column Watch”的這一部分中，討論了幾種策略，通過(guò)減少污染物，仔細選擇LC方法條件以及優(yōu)化MS接口設置來(lái)提高方法靈敏度。通過(guò)了解這些參數與電離效率之間的關(guān)系，分析人員可以提高其信噪比并實(shí)現LC-MS技術(shù)的隱藏潛力。

        在質(zhì)譜（MS）中，術(shù)語(yǔ)靈敏度可具有通?？苫Q使用的若干含義。靈敏度可定義為每單位分析物濃度變化的信號變化（例如校準曲線(xiàn)的斜率）^[1]。更常見(jiàn)的是，它用于參考MS檢測器中分析物產(chǎn)生的信號的大小。在后一種用法中，MS靈敏度通常用于比較檢測器。

        從根本上說(shuō)，檢測器提供定量數據的能力是分析物的信噪比（S / N）的函數。檢測限（LOD）由分析物S / N確定，是物質(zhì)的低濃度，其信號可與系統噪聲區分開(kāi)來(lái)^[2]。如圖1所示，如果背景噪聲保持不變，則MS的靈敏度越高，給定方法LOD的S / N值越大。因此，通過(guò)操縱S / N可以發(fā)生靈敏度的提高。MS優(yōu)化，樣品預處理策略，流動(dòng)相組成和LC色譜柱特性都是電離效率*的，并且在優(yōu)化時(shí)會(huì )改善分析物信號。同樣，限制有助于信號抑制或加合物形成的污染物也可以增強響應。

MS優(yōu)化

        在液相色譜 - 質(zhì)譜（LC-MS）中，靈敏度直接關(guān)系到從溶液中的分析物產(chǎn)生氣相離子的效率（電離效率）以及將它們從大氣壓轉移到MS系統的低壓區的能力。 （傳輸效率）^[3]。電離和傳輸效率的優(yōu)化取決于LC方法參數和目標分析物或分析物。為了進(jìn)行適當的調整，有必要對MS源中發(fā)生的機制有基本的了解。

        電噴霧電離（ESI）是zui流行的電離技術(shù)之一; 因此，它將成為本專(zhuān)欄文章的重點(diǎn)。然而，重要的是要注意，無(wú)論選擇何種電離模式，都必須優(yōu)化源參數。當LC流動(dòng)相流入樣品毛細管時(shí)，基于所選擇的極性分離正離子和負離子。在正ESI中，負離子在毛細管壁上被中和，并且正離子在流動(dòng)相中繼續到毛細管，其中帶電分析物累積成液滴。在施加電壓的影響下，形成泰勒錐[4]。靜電排斥導致錐體破碎成小的帶電液滴，然后，在毛細管和采樣板之間施加的電位差的引導下，它朝向采樣孔行進(jìn)。隨著(zhù)微小液滴向孔口前進(jìn)，溶劑在干燥氣體和熱量的作用下蒸發(fā)，導致液滴表面積減小，電荷密度增加。終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過(guò)程重復進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子^[5]。形成的離子云被稱(chēng)為 終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過(guò)程重復進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子^[5]。形成的離子云被稱(chēng)為 終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過(guò)程重復進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子^[5]。形成的離子云被稱(chēng)為離子羽。

        選擇合適的極性是開(kāi)發(fā)靈敏的LC-MS方法的步。選擇毛細管極性以匹配目標分析物的電荷。通常，堿性分析物通過(guò)接受質(zhì)子（M + H）⁺以正離子模式zui有效地電離，而酸性分析物通過(guò)提供質(zhì)子（MH）^-將在負離子模式中產(chǎn)生zui強的信號。然而，對于更復雜的分子，可能難以預測*極性模式。此外，分析物的行為和響應因儀器平臺而異。因此，在初始方法開(kāi)發(fā)期間或將現有方法轉移到新儀器時(shí)，使用兩種極性模式篩選分析物是有益的^[6]。

        電離效率受流速，流動(dòng)相組成和目標分析物的物理化學(xué)性質(zhì)的強烈影響。毛細管電壓設置取決于分析物，洗脫液和流速，并且可能對方法重現性產(chǎn)生重大影響。毛細管和采樣板之間施加的電位差是維持穩定和可重復噴霧的原因^[7]。如果毛細管電壓設置不正確，可能會(huì )出現可變電離和精度問(wèn)題。*霧化氣體流量和溫度也取決于洗脫液。霧化氣體限制了液滴的生長(cháng)，同時(shí)電荷累積并且還影響從毛細管發(fā)射的液滴的尺寸。應增加霧化氣體流量和溫度以獲得更快的LC流速或使用高含水流動(dòng)相時(shí)。類(lèi)似地，干燥氣體流量和溫度對于LC洗脫液的有效去溶劑化和氣相離子的成功生產(chǎn)是關(guān)鍵的。需要注意的是，在分析熱不穩定分析物時(shí)，必須注意防止其在源中降解。

        在電離源內產(chǎn)生氣相離子的位置對于*傳輸到MS系統是重要的。離子羽流的大小取決于發(fā)射氣相離子所需的裂變事件的數量及其與采樣孔的距離。通過(guò)基于LC流速調節毛細管相對于孔口的位置，可以?xún)?yōu)化離子羽流的取樣。在更快的流速下，毛細管應放置在離采樣孔更遠的位置，以便進(jìn)行充分的去溶劑化和增加裂變事件的數量。盡管延長(cháng)距離將允許產(chǎn)生更多數量的氣相離子，但排斥力也將成比例地增加，導致離子羽流的尺寸擴大并且氣相離子的密度減小。結果是，進(jìn)入采樣孔的離子數量會(huì )減少，導致信號強度下降^[3]。在較慢的流速下，形成較小的液滴，使毛細管更靠近取樣孔。較小的液滴更容易去溶劑化并且需要更少的裂變事件，減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細管和采樣孔之間的距離減小會(huì )增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率^[3]。減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細管和采樣孔之間的距離減小會(huì )增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率^[3]。減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細管和采樣孔之間的距離減小會(huì )增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率^[3]。

        如Szerkus及其同事分析尿液中7-甲基鳥(niǎo)嘌呤和葡萄糖醛酸所證明的，上述電離源參數的優(yōu)化可能會(huì )帶來(lái)2到3倍的靈敏度增益^[8]。在優(yōu)化源條件時(shí)，使用預期的LC流動(dòng)相和流速非常重要。一種優(yōu)化方法是多次注入標準溶液，并在每次注射時(shí)逐步改變特定的源參數。圖2展示了評估兩種農藥*去溶劑化溫度的過(guò)程：甲an磷和甲氨基阿維菌素B1a苯甲酸鹽。通過(guò)將去溶劑化溫度從400℃提高到550℃，使甲an磷的響應增加20％。相反，如果去溶劑化溫度超過(guò)500°C，由于該化合物的熱不穩定性，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽B1a經(jīng)歷*信號損失。或者，可以通過(guò)將恒定流量的分析物引入LC洗脫液并監測分析物TIC來(lái)優(yōu)化源條件。該技術(shù)允許在運行中進(jìn)行調整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應通過(guò)估算洗脫時(shí)的有機物濃度來(lái)優(yōu)化。盡管這一步驟勢不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強度分析物上即可簡(jiǎn)化該過(guò)程。該技術(shù)允許在運行中進(jìn)行調整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應通過(guò)估算洗脫時(shí)的有機物濃度來(lái)優(yōu)化。盡管這一步驟勢不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強度分析物上即可簡(jiǎn)化該過(guò)程。該技術(shù)允許在運行中進(jìn)行調整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應通過(guò)估算洗脫時(shí)的有機物濃度來(lái)優(yōu)化。盡管這一步驟勢不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強度分析物上即可簡(jiǎn)化該過(guò)程。

樣品預處理

        樣品預處理是LC-MS分析工作流程的重要組成部分，特別是在分析含有低濃度目標分析物的復雜樣品時(shí)。去除非目標樣品組分可以小化基質(zhì)干擾并改善目標分析物的S / N比。與目標分析物共洗脫的基質(zhì)化合物可能導致分析物信號的抑制或增強; 這些干擾稱(chēng)為矩陣效應。基質(zhì)效應通常表現為MS靈敏度或特異性的損失，并且在ESI中普遍存在，因為在發(fā)射氣相離子之前可能在液滴表面上發(fā)生電荷競爭。作為替代方案，如果感興趣的分析物是熱穩定的并且具有中等極性^[1]，則可以使用大氣壓化學(xué)電離（APCI）。在A(yíng)PCI中，通過(guò)電暈針的施加電壓，LC洗脫液在電離之前*蒸發(fā)成氣體。然后電離的流動(dòng)相蒸氣與分析物分子反應產(chǎn)生帶電離子。基質(zhì)效應在A(yíng)PCI中往往不那么廣泛，因為離子是通過(guò)氣相反應而不是液相反應產(chǎn)生的^[9]。

        可以使用各種樣品制備策略從潛在的干擾基質(zhì)組分中提取目標分析物。適當的技術(shù)取決于樣品基質(zhì)，樣品體積，目標分析物濃度和分析物理化學(xué)性質(zhì)。如果樣品清潔并且已知含有高濃度的目標分析物，簡(jiǎn)單的過(guò)濾和稀釋是降低潛在干擾濃度的快捷方便的方法。另一方面，已知含有低目標分析物濃度的復雜樣品將需要更嚴格的提取程序以改善信號強度。雖然由于需要投入的成本和時(shí)間，可能不需要更嚴格的樣品制備程序，無(wú)論選擇哪種樣品制備技術(shù)，重要的是要考慮基質(zhì)效應可能是由于內源性或外源性物質(zhì)的存在。盡管樣品中已存在內源性成分（蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，色素等），但在樣品預處理過(guò)程中將外源化合物引入樣品中。這些化合物可以從用于離心管，孔板和移液管的塑料中浸出，并且可以包括來(lái)自制造過(guò)程的副產(chǎn)物和殘余物（例如，模塑劑，增塑劑，穩定劑和釋放劑）。污染物的數量和類(lèi)型因制造商而異，如圖3a所示。在這個(gè)實(shí)驗中，對7家制造商的聚合物固相萃?。⊿PE）反相96孔板提取的污染物進(jìn)行了比較。通過(guò)LC-MS分析提取物，并將得到的數據減去背景以除去溶劑和分析柱的貢獻。所得色譜圖的疊加顯示各制造商之間存在多種化學(xué)污染物。基于由44Da分開(kāi)的一系列重復離子，在制造商C中清楚地識別聚乙二醇（PEG）的光譜（圖3b）。所得色譜圖的疊加顯示各制造商之間存在多種化學(xué)污染物。基于由44Da分開(kāi)的一系列重復離子，在制造商C中清楚地識別聚乙二醇（PEG）的光譜（圖3b）。所得色譜圖的疊加顯示各制造商之間存在多種化學(xué)污染物。基于由44Da分開(kāi)的一系列重復離子，在制造商C中清楚地識別聚乙二醇（PEG）的光譜（圖3b）。
 

       外源化學(xué)品的其他來(lái)源包括玻璃器皿（特別是用清潔劑清潔時(shí)），非MS級溶劑和添加劑的使用，或可能從皮膚或周?chē)h(huán)境中引入化學(xué)品的粗心工作實(shí)踐。如果沒(méi)有適當的實(shí)驗室程序和仔細篩選樣品預處理產(chǎn)品，可能會(huì )無(wú)意中將污染物引入樣品中。如果樣品經(jīng)過(guò)濃縮步驟，可能會(huì )觀(guān)察到S / N比降低，因為分析物和污染物都會(huì )被濃縮^[9]。

流動(dòng)相組成

        流動(dòng)相通過(guò)影響目標分析物的保留和電離，在LC-MS靈敏度中發(fā)揮關(guān)鍵作用。使用高純度溶劑和添加劑對于防止不需要的加合物形成和增加的MS背景是至關(guān)重要的。同樣，只有來(lái)自水凈化系統的超純水或適用于LC-MS的瓶裝水才能用于流動(dòng)相制備。收集的MS級和HPLC級甲醇的LC-MS譜顯示HPLC級甲醇中的雜質(zhì)顯著(zhù)增加，特別是在小分子分析中常見(jiàn)的低分子量范圍內（圖4）。從該數據可以明顯看出，較低等級溶劑的使用如何有助于降低靈敏度和卷積光譜，使得定量或光譜解釋變得困難。
 

圖4 HPLC級甲醇和LC-MS級甲醇的平均光譜的比較。流動(dòng)相：未指明的未改性甲醇; 流速：0.5 mL / min; 系統：采用ESI +電離的LC-MS; 掃描范圍：100-2000 m / z。

        將揮發(fā)性緩沖液和酸結合到流動(dòng)相中使得能夠控制目標分析物的電離狀態(tài)，從而可以操縱保留。分析物保留為L(cháng)C-MS分析人員提供了幾個(gè)優(yōu)勢。，增加的分析物保留意味著(zhù)在梯度LC期間從柱中洗脫分析物需要更高的有機溶劑濃度。已經(jīng)表明，具有較高有機濃度的液滴在MS源中更有效地去溶劑化，導致MS靈敏度提高^[11]。其次，更高的色譜選擇性使得可以避免可能對分析物響應有害的共洗滌基質(zhì)效應。通過(guò)同時(shí)輸注分析物后柱，同時(shí)通過(guò)分析柱^[12]進(jìn)行LC注入提取的空白基質(zhì)樣品，可以色譜監測保留區域和基質(zhì)抑制。基質(zhì)抑制區域的特征在于分析物信號的減少。通過(guò)這種方式，可以調整分析物保留，以避免色譜圖中顯著(zhù)抑制的區域。

        流動(dòng)相緩沖液和酸也會(huì )影響電離效率。這種說(shuō)法對于ESI尤其如此，因為由于電離競爭，它易于降低檢測器響應。為了降低緩沖液誘導抑制的可能性，通常應將濃度保持在低限度。或者，含有甲酸的流動(dòng)相可以使不需要的金屬加合物小化。由酸提供的質(zhì)子過(guò)量驅使大部分離子形成質(zhì)子化分子[M + H] ⁺，導致響應的總體改善，因為它不再分布在多個(gè)帶電物質(zhì)上^[12]。

        通過(guò)在酸離子改性劑的正離子模式下提供質(zhì)子或通過(guò)在負離子模式下接受基本改性劑的質(zhì)子，觀(guān)察到電離效率的提高。后者被證明是兩種中性雌激素，雌酮和雌三醇的負電離，當它們在含有0.2％氫氧化銨的稀釋劑中制備時(shí)，與含有0.2％乙酸的雌激素相比，它們的響應增加三倍^[14]。含氨的緩沖鹽（例如，甲酸銨或乙酸銨）可以提高極性中性化合物的電離效率，所述極性中性化合物不能通過(guò)形成銨加合物而自身電離。銨鹽可用于通過(guò)提供恒定的銨供應來(lái)防止形成不需要的加合物。例如，兩種強心苷的LC-MS分析，地gao辛和洋地黃毒苷幾乎*用甲酸銨改性的流動(dòng)相進(jìn)行。沒(méi)有甲酸銨，這些化合物傾向于形成鈉加合物，當通過(guò)串聯(lián)MS分析時(shí)難以破碎^[14]。
 

LC柱特性

        對提高LC-MS靈敏度的渴望趨向于使用更小的顆粒（亞2μm）和減小的柱直徑（≤2.1mm）實(shí)施LC柱。與全多孔顆粒（FPP）相比，表面多孔顆粒（SPP）的引入允許提率，同時(shí)降低系統壓力。從理論上講，柱可以提高靈敏度; 但是，必須考慮LC-MS系統的柱外體積，電離效率和數據采樣率，以充分實(shí)現其優(yōu)勢。

        色譜柱提供窄色譜峰的能力表征為其效率（N），并由其板高（H）定義。峰的效率是其寬度和保留時(shí)間的函數。有幾個(gè)過(guò)程有助于色譜柱內外的峰展寬。進(jìn)樣器，連接管和檢測器都是柱外峰展寬的來(lái)源。

        在色譜柱內部，渦流擴散（A），縱向傳質(zhì)（B）以及流動(dòng)相和固定相傳質(zhì)（C）都有助于峰的色散。總的來(lái)說(shuō)，這些術(shù)語(yǔ)構成了van Deemter等式：

        其中h是降低板高度，v是流動(dòng)相線(xiàn)速度^[2]。van Deemter方程作為比較柱性能的基礎。

        提高柱效的一種方法是減小粒徑。減小總峰寬將導致峰高的整體增加。假設探測器噪聲保持不變，較高的峰值會(huì )導致S / N的改善和靈敏度的提高。此外，峰可能更加分辨，降低了基質(zhì)干擾影響電離效率的可能性。

        較小的顆粒柱還允許使用更快的*線(xiàn)速度，并且通過(guò)擴展，更快的流速 - 不會(huì )經(jīng)歷效率的顯著(zhù)損失。不幸的是，由于控制ESI的機制，更快的流速通常不利于靈敏度，因為必須除去所有洗脫液才能成功形成氣相離子。雖然一些制造商聲稱(chēng)儀器兼容洗脫液流速高達1 mL / min，但據報道標準流量LC-ESI-MS系統的*性能發(fā)生在10-300μL/ min^[16]的范圍內。為了適應小顆粒及其相關(guān)的高線(xiàn)速度，2.1 mm內徑色譜柱已成為標準流量LC-ESI-MS系統的首xuan尺寸，*流速為200-300μL/ min。

        改變顆粒形態(tài)是提高柱效的另一種方法。表面多孔顆粒與全多孔顆粒的不同之處在于它們具有圍繞實(shí)心核的薄多孔殼。它們能夠顯著(zhù)提率，因為縱向擴散（B）和渦流擴散（A）的減少是由于它們的粒徑分布窄，滲透性降低和外表面粗糙^[17]。圖5使用van Deemter圖比較了全多孔3-μmC18色譜柱與相同尺寸的表面多孔2.7-μmC18色譜柱的動(dòng)力學(xué)性能。與全多孔顆粒相比，表面多孔柱的效率提高了60％。
 

圖5 Van Deemter圖比較3-μm全多孔C18柱和2.7-μm表面多孔C18柱之間的效率。流動(dòng)相A：45％水; 流動(dòng)相B：55％乙腈; 檢測：光電二極管陣列，254 nm; 注射量：1μL; 樣品：在25:75乙腈 - 水中制備的0.03mg / mL聯(lián)苯。

        利用內徑較窄的色譜柱可zui大限度地減少分析物稀釋?zhuān)@在色譜分離過(guò)程中會(huì )發(fā)生。由于柱上稀釋?zhuān)治鑫镬`敏度與濃度依賴(lài)性檢測器^[18]的柱內徑的平方成反比。因此，假設在兩種情況下都可以注入相同體積的樣品，理論上將2.1 mm內徑色譜柱切換到0.3 mm內徑色譜柱可以將靈敏度提高50倍^[19]。同樣，較小的內徑柱保持相同的線(xiàn)速度和降低的流速，這在電離效率方面是有益的。在這些流量下，對于需要高靈敏度且樣品量有限的應用，使用非常慢的流速（每分鐘納升）已經(jīng)變得流行。

        將窄孔柱與質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)，有幾個(gè)含義。柱內徑的減小與效率的提高一起導致峰值體積的顯著(zhù)降低。在不使儀器中的柱外體積小化的情況下，柱性能將受到損害，使得難以實(shí)現靈敏度的任何顯著(zhù)增加。大多數柱外體積貢獻可歸因于LC系統，MS貢獻可忽略不計。然而，發(fā)現用于將LC柱與MS系統連接的管道是關(guān)鍵的，因為該管道位于柱后，其中不會(huì )發(fā)生補償譜帶展寬的聚焦效應^[20]。根據經(jīng)驗，柱外體積不應超過(guò)色譜圖中窄峰的峰值體積的三分之一^[21]。例如，1.8μm，100 mm×2.1 mm色譜柱的峰容積約為8μL^[16]。因此，zui大柱外體積應小于3μL，以抵消系統相關(guān)的效率損失。

        較小的峰值體積也意味著(zhù)需要快速采集速率來(lái)收集定量數據所需峰值的小15-20個(gè)數據點(diǎn)。與時(shí)間相關(guān)的譜帶展寬效應可能是由于停留時(shí)間不足和數據平滑過(guò)度造成的。在圖6中，使用三種掃描速率（300ms，50ms和5ms）分析嗎啡和氫嗎啡酮。人工展寬對于300毫秒的數據是明顯的，而5毫秒的數據顯示過(guò)度采樣的過(guò)度噪聲。不正確的停留時(shí)間設置會(huì )對數據質(zhì)量和信噪比產(chǎn)生深遠的影響。此外，在分析大量化合物時(shí)，通過(guò)在選擇離子監測（SIM）或多反應監測（MRM）模式下收集數據可以實(shí)現更長(cháng)的循環(huán)時(shí)間，以減少與時(shí)間相關(guān)的譜帶展寬效應的發(fā)生。
 

圖6 采集的數據與（a）300 ms，（b）50 ms和（c）5 ms的停留時(shí)間的比較，以及它們對時(shí)間相關(guān)頻帶展寬的貢獻。系統：LC-MS / MS; 極性：ESI +。峰值：1 =嗎啡，2 =氫嗎啡酮。

結論

        開(kāi)發(fā)靈敏且穩健的LC-MS方法是一項艱巨的任務(wù)。為了解其目標分析物的物理化學(xué)性質(zhì)，以及MS電離和傳輸效率的機制和局限性，分析人員可以開(kāi)始做出明智的決策，以?xún)?yōu)化總體響應。提高靈敏度的簡(jiǎn)單，zui有效的方法是優(yōu)化電離源條件，以確保zui大限度地生產(chǎn)和將氣相離子轉移到MS系統中?？梢酝ㄟ^(guò)使用、窄孔LC柱，較慢的LC流速，仔細選擇樣品預處理程序改善響應以及減少可能導致基質(zhì)效應和基線(xiàn)噪音的干擾從而降低檢測限。
 

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